El electrodo de oxígeno: Diseño, teoría y operación práctica del electrodo de oxígeno

Una de las metodologías posibles para determinar la respiración celular o mitocondrial es cuantificar el consumo de oxígeno en preparados de células o mitocondrias. Esta cuantificación se puede realizar mediante diferentes técnicas; una de las más sencillas es el electrodo un oxígeno.

Electrodo de oxígeno

El electrodo de oxígeno comprende un cátodo de platino central (B) unido a una resina y un ánodo de plata (C) concéntrico unido por un puente electrolítico y conectados al módulo control.
La cámara del electrodo es preparada por aplicación de un espaciador de papel muy fino y una fina membrana de poli-tetra-fluor-etileno (P.T.F.E.) que es cuidadosamente fijada a la placa base donde se encuentran los electrodos por un anillo-O. En la presencia de oxígeno una pequeña corriente fluye a través de los electrodos que es proporcional a la concentración de oxígeno en la muestra. Esta señal es digitalizada por la unidad de control y presentada directamente en el PC.
Estos electrodos pueden ser acondicionados para medidas en fase líquida o en fase gaseosa.

Todas las unidades del electrodo deben mantenerse a temperatura constante durante las determinaciones. Este efecto se consigue por circulación de agua a la temperatura deseada alrededor de la cámara y controlando la temperatura de los componentes de la muestra. Este control es importante por dos razones:

1º.- El electrodo es sensible a la temperatura
2º.- El contenido en oxígeno de las muestras acuosas saturadas de aire cambia con la temperatura.

Durante la medida, el electrodo consume una pequeña proporción del oxígeno disponible. Para evitar registrar un declive en la señal debido a este artefacto, las muestras deben estar continuamente en agitación de forma que la capa de líquido, situada encima del disco del electrodo, sea constantemente repuesta en oxígeno.

Bibliografia

* J. F. Tresguerres, Jesaus A. Fernaandez-Tresguerres Hernandez. Biotecnología aplicada a la medicina. Editor Ediciones Díaz de Santos, 2003. 328 pp
* http://www2.uah.es/tejedor_bio/bioquimica_ambiental/guion-res-mitocondrial.pdf

Enfermedades mitocondriales: errores innatos del metabolismo que involucren a la mitocondria. Reacciones autoinmunes.

Las enfermedades mitocondriales son resultado de la falla de las mitocondrias, los compartimentos especializados presentes en cada célula del cuerpo, con excepción de los glóbulos rojos de la sangre. Las mitocondrias son las responsables de la creación de más del 90% de la energía que el cuerpo necesita para mantener la vida y apoyar el crecimiento. Cuando fallan, se genera cada vez menos energía al interior de la célula. Puede entonces presentarse lesión celular o incluso la muerte de la célula. Si este proceso se repite en todo el cuerpo, los sistemas completos comienzan a fallar

Apoptosis.

La mitocondria es un orgánulo que juega un papel muy importante en la apoptosis celular. Se trata de un colapso de la célula que comienza con la formación de de burbujas en la membrana plasmática y conlleva la fragmentación de proteínas, condensación de la cromatina, disminución del volumen celular y la degradación del ADN. El proceso termina con la formación de cuerpos apoptóticos que evitan la salida de todos estos compuestos al exterior y posible daño a células colindantes.

Existen dos vías de activación de la apoptosis:

• Vía extrínseca, intervienen receptores de muerte como FAS y FADD que se encuentran situados en la membrana citoplasmática y al unirse con sus ligandos específicos llevan a la activación de las caspasas.
• Vía intrínseca, esta es la mas importante en relación con la mitocondria. El citocromo C oxidado y otras proteínas se liberan de la mitocondria al citosol, señalización dada por por la proteína p53. Fuera de la mitocondria, el cit C se une a Apaf1, y a ellas se una la caspasa 9. Así se forma el apostosoma, que corta la procaspasa 3 e inicia la apoptosis. Esta vía puede ser activada por estrés oxidativo o por daño en el DNA.

Uno de los aspectos importantes en la patogénesis de las enfermedades vinculadas con la fosforilación oxidativa es una excesiva producción de especies reactivas del oxígeno, cuyos mecanismos ya han sido descriptos previamente. El otro aspecto es la capacidad de la mitocondria para virar hacia el estado de apoptosis. Este viraje aparentemente involucra la apertura de un canal inespecífico interno llamado poro de permeabilidad mitocondrial de transición (mtPTP). El espacio de la membrana interna mitocondrial contiene un número de factores proapoptóticos incluyendo el cyt c, el factor inductor de apoptosis y las caspasas.

La apertura del mtPTP produce colapso del gradiente electroquímico, que conduce al edema de la membrana interna mitocondrial con liberación de los factores apoptóticos. El cyt C activa la vía de la degradación proteica de las caspasas lo que produce destrucción del citoplasma.

Las enfermedades mitocondriales poseen una amplia variedad de elementos heredados y los fenotipos pueden ser diversos y superpuestos. Es decir que una misma mutación del mtDNA puede producir diversos fenotipos, y diferentes mutaciones pueden producir fenotipos similares. Por lo tanto en las patologías que tienen su origen en la mitocondria se ha considerado más adecuado clasificar a los pacientes por su defecto genético más que por sus manifestaciones clínicas.

Estas enfermedades por lo general tienen un inicio tardío y son de curso progresivo. Esto significa que la expresión fenotípica de estas enfermedades comprende dos factores: una predisposición a la mutación y un factor relacionado con la edad que produce una declinación de la función mitocondrial que a su vez exacerba el efecto heredado. La tabla nos muestra los síndromes clínicos más conocidos secundarios a defectos de mtDNA.

Bibliografia

*Boveris. Alberto. La mitocondria: estructura, función y especies reactivas del óxigeno. Antioxidantes y Calidad de Vida. Cátedra de Fisicoquímica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. 1994
*PF Chinnery, DM Turnbull Mitochondrial DNA and disease. Lancet 1999;354: 17-21.
*Lestienne P: Mitochondrial DNA mutations in human disease: A review. Biochimie 1992

Descubrimiento, aislamiento y propiedades de la mitocondria y sus componentes principales.

Es el sitio donde se lleva a cabo la respiración celular, el metabolismo aerobio, en la mayoría de los organismos eucariontes. Lo anterior fue demostrado por A. Lenhinger y E. Kennedy en 1948. Este organelo fue descubierto en el siglo XIX.

1880-1888- Probablemente las primeras observaciones se deben al botánico suizo Kolliker, quien notó la presencia unos gránulos en células musculares de insectos a los que denominó sarcosomas. Llegó a la conclusión de que presentaban membrana.

1882- El alemán Walther Flemming descubrió una serie de inclusiones a las que denomina fila.

1884- Observaciones por Richard Altmann, quien más tarde en su obra publicada en Leipzig Die Elementarorganismen describe una serie de corpúsculos que observa mediante una tinción especial que incluye fucsina. Especula que se trata parásitos independientes, con su propio metabolismo y los denomina bioblastos.

1916- El anterior hallazgo fue rechazado como un artefacto de la preparación, y sólo más tarde fue reconocido como mitocondrias por N.H. Cowdry. También los "plastídulos" del protozoólogo italiano Leopoldo Maggi podrían tratarse de observaciones tempranas de mitocondrias.

1889- Carl Benda, denominó "mitocondria" a unos gránulos que aparecían con gran brillo en tinciones de violeta cristal y alizarina, y que anteriormente habían sido denominados "citomicrosomas" por Velette St. George.

1904- F. Meves confirma su presencia en una planta, concretamente en células del tapete de la antera de Nymphaea

1913- Otto Heinrich Warburg descubre la asociación con enzimas de la cadena respiratoria, aunque ya Kingsbury, en 1912 había relacionado estos orgánulos con la respiración celular.

1934- Fueron aisladas por primera vez a partir de homogeneizados de hígado

1948- Hogeboon, Schneider y Palade establecen definitivamente la mitocondria como el lugar donde se produce la respiración celular.

1963- La presencia del ADN mitocondrial fue descubierta por Margit M. K. Nass y Sylvan Nass.

Propiedades

La mitocondria consta de 2 membranas paralelas separadas por un espacio estrecho (membrana externa e interna en razón a su ubicación) o interestructural.
La membrana mitocondrial externa es lisa y contiene porinas, lo que permite el libre paso de moléculas mayores de 10 kD entre la mitocondria y el citosol.

El espacio entre ellas esta ocupado por una sustancia homogénea denominada matriz mitocondrial que es de menor opacidad a los rayos electrónicos, contienen enzimas del ciclo del acido citrico . La membrana interna emite hacia el interior de la mitocondria evaginaciones laminares a manera de tabiques incompletos que no llegan a segmentar el espacio interestructural. Estas prolongaciones se denominan crestas mitocondriales.

Particulas elementales

Dentro de la membrana interna encontramos estructuras que miden entre 80 a 100 A y estan distribuidas en la superficie de la membrana interna. Su número varía entre 10000 a 100000 por mitocondria. Cada particula consta de cabeza, tallo y pieza basal. La cabeza mide 100 amstrongs de diametro y el pediculo mide 40 a 50 amnstrongs aprox.
Se sostiene que las particulas elementales contienen enzimas que participan en el transporte de electrones y fosforilacion oxidativa.

Matriz mitocondrial

En el espacio intraestructural se encuentra la matriz que contiene algunos granulos esfericos escasos de aprox 50 amnstrongs; tambien algunos filamentos. Se les vincula probablemente con ADN, tambien se demostro la existencia de metales bivalentes, calcio, magnesio y estroncio ademas de vitaminas.
La matriz está formada casi por un 50% de de agua, contiene alta concentración de enzimas solubles para el metabolismo oxidativo, asi como substratos, cofactores e iones inorgánicos. Contiene la maquinaria genética propia del organelo, ADN, ARN y ribosomas que participan en la síntesis de algunos componentes protéicos mitocondriales, el resto de las proteínas son importadas del citoplasma después de su expresión desde el núcleo.

Las membranas mitocondriales estan costituidas por fosfolipidos y proteinas en una proporcion de 1/5 a favor de las proteinas .ambos materiales se unen formando un reticulo lipido proteico.

Todas las funciones dependen del aporte continuo de energía obtenido al degradar moléculas orgánicas durante la respiración celular.

En la mitocondria tienen lugar las siguientes funciones:

 Oxidación del piruvato o ácidos grasos a co2, acoplada a la reducción de los portadores electrónicos nad+ y fad (a nadh y fadh2). Estos ceden sus electrones a la cadena de transporte electrónico.
 Transferencia de electrones desde el nadh y fadh2 al o2, acoplada a la generación de fuerza protón-motriz.
 Utilización de la energía almacenada en el gradiente electroquímico de protones para la síntesis de ATP por el complejo ATPasa.

Bibliografia

*Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson D. Molecular biology of the cell. Nueva York. Garland Publishing Inc, 2000.

*Stoppani A, Boveris A: La mitocondria y la estructura de la cadena de transporte de electrones. En Bioquímica General (Torres H, Carminai H, Cardini C; Eds.) El Ateneo, Buenos Aires 1983; 453-473.

Biogénesis de la mitocondria: DNA mitocondrial.

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares cuya misión principal es la producción de energía en forma de ATP. Estos orgánulos contienen su propio sistema genético que codifica un número pequeño de proteínas que forman parte del sistema de fosforilación oxidativa. El resto de las proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo.

La biogénesis de la mitocondria requiere la expresión coordinada de los dos sistemas genéticos celulares, el nuclear y el mitocondrial. Los genes están dispuestos en el DNA mitocondrial humano de una forma compacta y no contienen intrones.
Se conocen bastante bien los mecanismos básicos de replicación y transcripción del DNA mitocondrial, así como los elementos y proteínas implicadas. La mitocondria posee, asimismo, su propia maquinaria para la síntesis de las proteínas codificadas en su genoma.
La genética del DNA mitocondrial difiere de la del DNA nuclear en una serie de propiedades. En particular, el genoma mitocondrial se hereda exclusivamente de la madre que lo transmite a todos sus hijos.


Importación de proteínas codificadas en el núcleo hacia la mitocondria.

Los mecanismos de exportación de proteínas, desde el núcleo, fueron descritos en 1958 por Goldstein en experimentos de transplante de núcleos de Amaeba.
Se han identificado una serie de secuencias NES (Nuclear Export Sequence). Este transporte es saturable, indicando la existencia de un receptor.
El transporte entre el citoplasma y el núcleo tiene lugar a través de los poros nucleares que actúan de forma selectiva permitiendo la difusión de moléculas de pequeño tamaño y siendo necesario un mecanismo de transporte activo para moléculas de mayor tamaño denominado transporte regulado.

Aunque la contribución del ADNmt es esencial, la mayor parte de la información para la función y biogénesis mitocondrial se encuentra en el genoma nuclear. Estos genes, son transcritos y eventualmente traducidos en el citosol.

Las proteínas resultantes son posteriormente transportadas al compartimento mitocondrial. Uno de los requerimientos para la importación exitosa de la mayoría de proteínas, es la presencia de un péptido señal o presecuencia mitocondrial, es decir, una extensión polipeptídica en el extremo amino terminal de la proteína que dirige a la proteína recién sintetizada hacia la mitocondria.

Esta presecuencia es generalmente pequeña (de 20 a 60 residuos de aminoácidos), capaz de formar una alfa-hélice anfifílica, que puede ser reconocida por la maquinaria de importación mitocondrial.
El tránsito de las proteínas desde el citoplasma hasta su destino final en alguno de los compartimentos mitocondriales requiere, además de las presecuencias mitocondriales, a chaperonas citosólicas y de la matriz mitocondrial, receptores localizados en la superficie
mitocondrial, proteínas que rodean los canales de paso y proteínas de maduración.

La inserción de las presecuencias en la membrana interna requiere además, en la mayoría de los casos, que en la mitocondria exista un potencial electroquímico (ΔΨ), para promover el movimiento electroforético de cargas positivas a través del aparato importador.
Finalmente, una proteasa de la matriz mitocondrial cataliza (MPP) la remoción proteolítica de la presecuencia mitocondrial, obteniéndose así, una proteína madura.
Las proteínas cuya localización funcional se restringe a la membrana externa mitocondrial, suelen no presentar presecuencia. Al ser reconocidas por los receptores mitocondriales de la membrana externa, son transportadas a su destino final en la membrana externa o en el espacio
intermembranal.

Una vez en la matriz mitocondrial la secuencia señal se elimina y tiene lugar el plegamiento de la proteína.

En el esquema se muestran los diferentes compartimentos mitocondriales: ME, membrana externa (arriba); MI, membrana interna (abajo); C, citosol; EI, espacio intermembranal; M, matriz mitocondrial. Las proteínas que poseen presecuencia o señales, interaccionan con la superficie externa mitocondrial a través de receptores (R). Aquellas proteínas que se localizan en la matriz o membrana interna se translocan a través de complejos en la membrana interna. En la matriz mitocondrial, estas porteínas interaccionan con la chaperona mitocondrial (heat shock protein mHSP70) y la proteasa (MPP). Esta última corta específicamente a las presecuencias o péptido señal, para generar a las proteínas maduras; que posteriormente entran en contacto con las proteínas involucradas en la inserción de proteínas para su correcta localización en la membrana interna. Aquellas proteínas que carecen de presecuencia, pero que putativamente contienen una secuencia señal interna (una secuencia de la propia proteína madura), ingresan a través de un camino distinto sin llegar a la matriz mitocondrial. La importación de proteínas requiere la presencia de un gradiente electroquímico (ΔΨ) en la membrana interna mitocondrial.

Bibliografia

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*Laskowski, Wolfgang; Pholit, Wolfgang. Biofisica. Ediciones Omega S.A. Casanova, 220. Barcelona. 1976

Origen y evolución de la mitocondria

Las mitocondrias tienen similitudes con las bacterias como tamaño y forma pero existen muchas más. La matriz mitocondrial, contiene DNA, RNA y ribosomas que participan en la síntesis de algunos componentes mitocondriales, el resto de los componentes es importado del citoplasma después de su expresión desde el núcleo.

Se sabe que, a pesar de esto, las mitocondrias se reproducen por fisión binaria y además su proceso respiratorio es similar al observado en bacterias aerobias actuales. A partir de estas observaciones, Lynn Margulis propuso que el origen de las mitocondrias modernas es a partir de la endosimbiosis de bacterias aerobias con eucariontes anaerobios antiguos. El origen de diversos organelos también se puede explicar a partir de la teoría endosimbiótica.

Hipótesis endosimbiótica.

Como lo mencione anteriormente, esta hipótesis fue desarrollada por la bióloga Lynn Margulis.
Esta es una hipótesis plausible del origen de los eucariotas que dice que un procariota primitivo con metabolismo anaeróbico, heterótrofo endocitó procariotas aeróbicos. Sin embargo, los aeróbicos capturados pudieron resistir a la estructura intracelular y siguieron viviendo en el citoplasma de la célula huésped de modo simbiótico, desarrollándose como mitocondrias y ocupándose de volver el metabolismo aeróbico y energéticamente eficiente.
Se habría producido una endosimbiosis en serie y algunos autores hablan de la célula eucariota vegetal como una comunidad microbiana bien organizada.

La endosimbiosis primaria resulta de asociaciones ancestrales y que suponen una gran alteración del ADN de la bacteria y del hospedador, que se ha adaptado para mantenerlas. Posteriormente se han producido otras endosimbiosis de cianobacterias en células eucariotas con mitocondrias denominadas endosimbiosis secundarias y terciarias.

Una endosimbiosis secundaria ocurrió cuando una célula eucariota con mitocondrias endocito a otra eucariota que ya contenía cloroplastos y mitocondrias. Con el tiempo la célula incorporada pasó a ser endosimbionte. La célula endocitada perdió el núcleo, o se atrofió, y su cloroplasto pasó a trabajar y a depender de la célula eucariota donde se incorporó. La endosimbiosis terciaria resulta cuando una célula eucariota que había sufrido una endosimbiosis secundaria incorpora a otra eucariota que también era resultado de una endosimbiosis secundaria.

También se supone que la célula huésped generó otros orgánulos celulares mediante plegamientos de su membrana plasmática lo que, finalmente, transformó al procariota aeróbico heterótrofo en eucariota unicelular.


La Eva mitocondrial.

Esta hipótesis se sustenta en estudios realizados con el ADN contenido en las mitocondrias que se encuentran en todas las células. Las mitocondrias contienen sistemas enzimáticos altamente integrados que aportan energía para el metabolismo celular, es decir, para la vida misma de las células. Cuando en la fecundación se fusionan el óvulo y el espermatozoide, las únicas mitocondrias que van a formar parte de las células del embrión que se forma proceden del óvulo, de manera que el ADN mitocondrial se hereda solo por línea materna.

El ADN nos permite seguir el rastro de sus estructuras hacia atrás. Esto puede hacerse por miles de generaciones hasta llegar a la “abuela” ancestral de la especie humana.

Esta Eva vivió en África hace 150 mil años y pertenecía a una tribu de la cual todos los seres humanos descendemos. Como los seres humanos solo heredámos ADN mitocondrial materno, podemos decir que somos parientes y este ADN nos unifica.

Bibliografía.

*Alvarez, Silvia; Novoa Bermudez, Ma. José; Boveris, Alberto "La mitocondria:
estructura, función y especies reactivas del óxigeno" Antioxidantes y Calidad de Vida. Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, 1994
*Alberts, B., Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson D. "Molecular biology of the cell" 3a. Ed. Nueva York. Garland Publishing Inc, 2000
*Álvarez Iglesias, Vanesa "Estudio multidisciplinar de la variabilidad del ADN mitocondrial en poblaciones humanas" Editor Univ Santiago de Compostela