miércoles, 21 de abril de 2010

Cuestionario final

1.- ¿Quien propuso la teoría endosimbiótica?
Lynn Margulis

2.-¿Que dice esta teoría?
dice que un procariota primitivo con metabolismo anaeróbico, heterótrofo endocito procariotas aeróbicos.

3.-¿Que se requiere para importar exitosamente una proteína hacia la mitocondria?
La presencia de un péptido señal o presecuencia mitocondrial, es decir, una extensión polipeptídica en el extremo amino terminal de la proteína que dirige a la proteína recién sintetizada hacia la mitocondria.

4.-¿En que año se aislaron por primera vez las mitocondrias?
En 1934

5.-¿Que son las crestas mitocondriales?
La membrana interna emite hacia el interior de la mitocondria evaginaciones laminares a manera de tabiques incompletos que no llegan a segmentar el espacio interestructural. Estas prolongaciones se denominan crestas mitocondriales.

6.-¿Que contiene principalmente la matriz mitocondrial?
Contiene la maquinaria genética propia del organelo, ADN, ARN y ribosomas que participan en la síntesis de algunos componentes protéicos mitocondriales.

7.-Explica las vías de activación de las apoptosis

• Vía extrínseca, intervienen receptores de muerte como FAS y FADD que se encuentran situados en la membrana citoplasmática y al unirse con sus ligandos específicos llevan a la activación de las caspasas.
• Vía intrínseca, esta es la mas importante en relación con la mitocondria. El citocromo C oxidado y otras proteínas se liberan de la mitocondria al citosol, señalización dada por por la proteína p53. Fuera de la mitocondria, el cit C se une a Apaf1, y a ellas se una la caspasa 9. Así se forma el apostosoma, que corta la procaspasa 3 e inicia la apoptosis. Esta vía puede ser activada por estrés oxidativo o por daño en el DNA.

8.-¿Cuales son los principales transportadores electrónicos de la cadena respiratoria?
1. NAD y NADP: asociadas a deshidrogenasas, participan en la transferencia de 2 electrones.
2. Flavinas: implicadas en la transferencia de 1 o 2 electrones
3. Quinonas: implicadas en la transferencia de 1 o 2 electrones
4. Complejos hierro azufre, grupos hemo, iones cobre: implicados en transferencia de 1 solo electrón

9.-¿Que relación existe entre el gradiente electroquimico y sintesis de ATP en la fosforilacion oxidativa?
El gradiente electroquimico esta formado por una diferencia entre valores de pH entre ambos lados de la membrana y tambien una diferencia de potencial electrico. Este gradiente se produce debido a la impermeabilidad de la membrana a los p+ y a la existencia del flujo de e- a trtaves de la cadena respiratoria

10.-¿Que son los desacoplantes?
Son aquellos compuestos que actuan inhibiendo la relacion que existe entre la cadena respiratoria y el complejo ATPasico. Estos compuestos transportan protones o iones desde el espacio intermembranico a la matriz mitocondrial desviandolos de su ruta normal hacia el complejo ATPasico .

11.-¿Que es la ubiquinona?
Es un transportador de electrones móvil que se desplaza por la bicapa lipídica de la membrana interna mitocondrial.
Lleva dos electrones y dos protones, tomados del complejo I o del complejo II, hasta el complejo III.

12.-¿Cual es la HIPÓTESIS DEL ACOPLAMIENTO QUIMIOSMÓTICO?
Dice que: "La energía del transporte electrónico impulsa un sistema de transporte activo que bombea protones fuera de la matriz mitocondrial, lo cual genera un gradiente electroquímico que posibilita la síntesis de ATP"

13.-¿Cuales son los tipos de inhibidores que existen?
Hay 2 tipos de inhibidores que inhiben la cadena de transporte electrónico y la síntesis de ATP.

14.-¿Para que se utilizan las partículas submitocondriales?
Para estudiar el transporte de sustancias en las membranas.

15.-¿Que es el complejo F1?
Éste es un motor minúsculo de proteína que es un componente de una máquina celular llamada la mitocondria.

16.-Explica el mecanismo de F1
En este mecanismo de funcionamiento existe una diferencia de gradiente de protones entre el espacio intermembrana de la mitocondria y la matriz mitocondrial. Este gradiente provoca el paso de protones a través del complejo F0 de la ATP sintasa. Este paso de los protones provoca un giro de las subunidades c de la porción F0, este giro va a ser transmitido al eje gamma. Este eje interacciona con las subunidades catalíticas de la porción F1, produciendo cambios conformacionales en las subunidades proteicas disminuyendo la energía de activación de la reacción que transforma el ADP a ATP.

17.-¿Que es la bioenergetica?
Describe la transferencia y utilización de la energía en los sistemas biológicos. Utiliza las ideas básicas de la termodinámica, particularmente el concepto de energía libre.

18.-¿Que determina el grado de energía libre?
La dirección y cantidad a la cual procede una reacción está determinada por el grado energía libre que dos factores cambian durante la reacción. Estos factores son la entalpía (DH, una medida del cambio de calor entre los reactivos y productos de la reacción) y la entropía (DS, una medida del cambio en el desorden de los reactivos y productos)

19.-¿En que consiste la fosforilación oxidativa?
acoplada a una cadena de transporte de electrones ubicada en una membrana
• Se aprovecha la energía derivada de la oxidación de nutrientes: cadena de transporte electrónico mitocondrial.
• Se aprovecha la energía de la luz: cadena de transporte electrónico fotosintética.

20.- Explica el mecanismo de acoplamiento
Esta teoría consiste en tres postulados:

a) la membrana interna es impermeable a protones y a hidroxilos,
b) la cadena respiratoria transloca protones hacia el medio extramitocondrial citosólico (dos protones por cada dos electrones) en un proceso vectorial acoplado al transporte de electrones a través de los sitios de conservación de energía, y
c) la ATPasa (ATPsintetasa) es una enzima que transporta vectorial y, reversiblemente, protones con una estequiometría característica: dos protones por Pi incorporado (o liberado) del ATP. La síntesis de ATP se relaciona con la entrada de protones a la matriz mitocondrial

Bioenergética


La bioenergética describe la transferencia y utilización de la energía en los sistemas biológicos. Utiliza las ideas básicas de la termodinámica, particularmente el concepto de energía libre.
Los cambios en la energía libre (DG) proveen una cuantificación de la factibilidad energética de una reacción química y pueden proveer de una predicción de si la reacción podrá suceder o no.

La bioenergética se interesa sólo por los estados energéticos inicial y final de los componentes de una reacción, no del mecanismo o del tiempo necesarios para que el cambio químico se lleve a cabo. La bioenergética predice si un proceso es posible; la cinética cuantifica qué tan rápido ocurre la reacción.


Energía libre

El cambio de energía libre de Gibbs(ΔG) es la función termodinámica más útil para predecir la espontaneidad de una reacción. Una reacción es espontánea cuando ΔG es negativo.

En cualquier reacción de un ser vivo la ΔG debe ser menor de cero para que se formen productos. Según la concentración de sustratos y productos en la célula (o en un compartimentode ésta), el signo de ΔG puede cambiar.

Muchos procesos bioquímicos endergónicos se realizan gracias al acoplamiento a reacciones exergónicas. El ATP suministra energía libre para conducir muchas reacciones endergónicas. Los otros nucleósidostrifosfato(GTP, UTP y CTP) pueden dirigir reacciones de forma análoga al ATP, aunque el ATP se encuentra en mucha mayor concentración en las células.

La hidrólisis de los enlaces anhídrido fosfórico del ATP desprende gran cantidad de energía libre.


Bases estructurales del elevado potencial de transferencia de grupos fosforilodel ATP

-Sus productos de hidrólisis (ADP, Pi) están estabilizados por resonancia.
-Repulsión electrostática del ATP por acumulación de cargas del mismo signo.
-Estabilización por hidratación de los productos de hidrólisis


La dirección y cantidad a la cual procede una reacción está determinada por el grado energía libre que dos factores cambian durante la reacción. Estos factores son la entalpía (DH, una medida del cambio de calor entre los reactivos y productos de la reacción) y la entropía (DS, una medida del cambio en el desorden de los reactivos y productos)

El ATP tiene un potencial de transferencia del grupo fosforilointermedio entre las moléculas fosforiladas: buen transportador de grupos fosforilos de una a otras.

¿Cómo sintetizan ATP las células?

Fosforilación oxidativa
• Funciona acoplada a una cadena de transporte de electrones ubicada en una membrana
• Se aprovecha la energía derivada de la oxidación de nutrientes: cadena de transporte electrónico mitocondrial.
• Se aprovecha la energía de la luz: cadena de transporte electrónico fotosintética.

Fosforilación a nivel de sustrato

• Reacciones enzimáticas integradas en rutas metabólicas
Bibliografía


*B. Jackson, Meyer. Molecular and Cellular Biophysics. University of Winsconsin. Medical School. Ed. Cambridge 2006
*Laskowski, Wolfgang; Pohlit, Wolfgang. Biofisica: Introducción para médicos, biólogos y fisícos. Ediciones Omega. Barcelona 1976
*Albert L. Lehninger. Bioenergética: la base molecular de las transformaciones biológicas de energía. Traducido por Vicente Conejero Tomás Editor Fondo Educativo Interamericano, 1975

Sintesis de ATP: Arquitectura molecular de la proteìna F1ATPasa



La ATP sintasa está situada en la membrana interna de las mitocondrias (también existen en los cloroplastos pero esto mejor para otra entrada). Esta compuesta por dos complejos, el complejo F0 que es el complejo transmembrana y el complejo F1 situado mirando hacia la matriz mitocondrial.

F1 es una agrupación de cinco tipos de subunidades que se proyecta hacia la matriz mitocondrial. En general se acepta que F1 contiene 6 sitios de unión para nucleótidos.

Éste es un motor minúsculo de proteína que es un componente de una máquina celular llamada la mitocondria. Cuando las células extraen energía del alimento, pelan los electrones y los transmiten debajo de la membrana mitocondrial. Esto genera una corriente eléctrica minúscula que se utiliza para impulsar desde otro motor de la proteína, los protones de las bombas fuera de la mitocondria. Los protones pueden fluir nuevamente dentro de la mitocondria, solamente con el F1 ATPasa.

El flujo del protón que resulta, hace girar el rotor del F1 ATPasa.

El F1 ATPasa tiene siete porciones hechas a partir de tres diversas proteínas, cada una codificadas por diversos dígitos binarios del genoma. El rotor que gira acciona un martillo molecular que junta las moléculas para hacer un producto químico llamado ATP, que las células utilizan para producir energía.
En este mecanismo de funcionamiento existe una diferencia de gradiente de protones entre el espacio intermembrana de la mitocondria y la matriz mitocondrial. Este gradiente provoca el paso de protones a través del complejo F0 de la ATP sintasa.

Este paso de los protones provoca un giro de las subunidades c de la porción F0, este giro va a ser transmitido al eje gamma. Este eje interacciona con las subunidades catalíticas de la porción F1, produciendo cambios conformacionales en las subunidades proteicas disminuyendo la energía de activación de la reacción que transforma el ADP a ATP.

Este mecanismo de la catálisis rotacional fue propuesto por Paul Boyer que fue Premio Nobel en 1997 gracias a este descubrimiento.

La enzima probablemente lleva a cabo un ciclo de tres fases catalítico. En la primera fase, ADP y fosfato se unen a un centro activo, que cataliza la formación de ATP unido. Este paso es energéticamente posible gracias a la energía libre liberada, por fuerza vinculante del ATP al centro activo, que compensa la inestabilidad de la unión fosfo anhídrido.
Bibliografia


*David G. Nicholls, José Ignacio García de Gurtubay García, Eduardo Rial Zueco.
Bioenergética: introducción a la teoría quimiosmótica. Traducción: José Ignacio García de Gurtubay García, Eduardo Rial Zueco. Editor Reverte, 1987
*Juli G, Peretó. Fundamentos de bioquímica. Volumen 96 de Educación Universidad de Valencia Ed. Universitat de València, 2007

Partìculas submitocondriales: aislamiento y propiedades

Se forman artificialmente destruyendo la mitocondria con ultrasonido con lo cual las crestas forman vesículas quedando las partículas F1 en la superficie externa de dichas vesículas las cuales se llaman partículas transportadoras de electrones ó partículas submitocondriales ; consisten entonces en un elemento artificial que se hace en el laboratorio para poder estudiar mejor a la mitocondria

Para estudiar el transporte de sustancias en las membranas, dado que en general se tienen vesículas u organelos cerrados, el procedimiento consiste en colocar a éstos en presencia del material que supuestamente se va a transportar, dejar transcurrir un cierto tiempo que puede ser desde unos cuantos segundos hasta horas, y luego separar las vesículas del medio en que se les ha colocado por distintos procedimientos.

Los procedimientos más frecuentes en este tipo de estudios que consisten en la separación de las vesículas por filtración, por centrifugación, o por el empleo de columnas. En todos los casos el principio es esencialmente el mismo, y se trata de obtener aisladas las vesículas y el medio en que se habían colocado, para detectar diferencias entre el estado inicial y el logrado después de un cierto periodo de incubación.

Para el aislamiento de las partículas se utiliza el procedimiento para preparar vesículas a partir de mitocondrias mediante el ultrasonido, en el que ocurre la ruptura de las mitocondrias principalmente debido a la estructura que éstas tienen, dando lugar a las llamadas partículas submitocondriales, que además de estar constituidas esencialmente por los mismos componentes de las membranas de la mitocondria entera, están dispuestas en forma invertida en su mayoría, es decir, lo que era el interior de la mitocondria es ahora el exterior de la partícula y viceversa.

Bibliografía:



*Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson J: The mitochondrion. In Molecular Biology of the Cell, 2nd edition (Robertson M. Ed.) Garland Publishing, New York 1989
*Silvia Alvarez, María José Novoa Bermudez y Alberto Boveris. *La mitocondria: estructura, función y especies reactivas del óxigeno. Antioxidantes y Calidad de Vida. Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. 1994


Inhibidores, desacoplantes y ionóforos

Hipótesis del acoplamiento quimiostático

"La energía del transporte electrónico impulsa un sistema de transporte activo que bombea protones fuera de la matriz mitocondrial, lo cual genera un gradiente electroquímico que posibilita la síntesis de ATP."

Esta hipótesis se basa en:
i) la existencia de un gradiente electroquímico: Se genera una diferencia de potencial (voltaje) de transmembrana y pHmatriz > pHintermembrana
ii) un sistema de membrana intacta o en forma de vesícula cerrada.

El uso de los agentes desacoplantes, de los inhibidores y/o de los ionóforos son apoyos adicionales a esta hipótesis.

Inhibición del transporte electrónico (síntesis de ATP).

Hay 2 tipos de inhibidores que inhiben la cadena de transporte electrónico y la síntesis de ATP.

Inhibidores de la cadena.
Se han descrito inhibidores específicos para cada uno de los complejos de la cadena.
- Complejo I: rotenona y amitol.
- Complejo II: malonato.
- Complejo III:
- Complejo IV: cianuro, CO y azida.
Si se bloquea la cadena de transporte electrónico cesa el consumo de O2. Estos inhibidores han sido importantes para determinar el orden de los complejos en la cadena de transporte electrónico. Si no hay consumo de O2 no habrá gradiente de H+ y no se sintetizará ATP.

Inhibidores de la síntesis de ATP.
El inhibidor de la ATP sintasa es la oligomirina, que bloque la cadena y la síntesis de ATP.



Sitio de acción de los inhibidores sobre la cadena respiratoria

Partículas submitocondriales se suspenden en un medio que contiene NADH y la concentración de oxígeno en el medio se mide con el electrodo de platino. La máxima concentración de oxígeno , 0.22 mM, corresponde a la parte superior del gráfico. A medida que las partículas respiran, la concentración de oxígeno disminuye linealmente. La adición de rotenona inhibe la respiración y la pendiente del trazado disminuye. En ese momento, la adición succinato activa nuevamente la respiración que es inhibida por antimicina. La adición del sistema ascorbato-tetrametil-p-fenil-endiamina (TMPD) activa otra vez la respiración que puede ser inhibida por cianuro. Finalmente, el ditionito agota el oxígeno en el medio, cuya concentración se reduce a cero.
Desacopladores

Otras moléculas inhiben la síntesis de ATP desacoplándola de la cadena de transporte electrónico, y aunque no haya síntesis la cadena sigue funcionando. Un desacoplador deshace el gradiente de H+ sin parar la cadena. El más común es el 2,4-dinitrofenol que es soluble en la membrana y su grupo oh se puede disociar. Esto libera energía en forma de calor. Tanto el ATP como el ADP necesitan un transportador para salir y entrar de la matriz mitocondrial y este transporte está favorecido por el gradiente de H+.

En la membrana interna de la mitocondria hay un transportador que a la vez que saca atp mete ADP + Pi y esto está dirigido por el potencial de membrana. Los Pi entran gracias a un transportador que se mueve por un gradiente de concentración. Este transportador cotransporta H+ y Pi y aprovecha la energía del gradiente para a la vez que se introduce H+ introducir Pi. Los desacopladores pueden ser fuente de calor para aumentar la temperatura de la célula. Esto es utilizados por neonatos y animales que hibernan. A esta proteína desacopladores se le llama termogenina.

Ionóforos

Son compuestos que forman estructuras ciclicas que actuan como canales de iones inhibiendo especificamente la magnitud del potencial de membrana , por ejemplo la valinomicina es un antibiotico liposoluble que actua formando un complejo especifico con el ion potasio , permiten a los iones inorgánicos atravesar la membrana. estos ionoforos desacoplan la cadena de transferencia de electrones de la fosforilación oxidativa disipando la contribución eléctrica al gradiente electroquímico a través de la membrana mitocondrial. otro antibiotico es la nigericina , actua como antiporter K+ / H transportando protones en una direccion


Concepción quimioosmótica del mecanismo de acoplamiento

Uno de los eventos tempranos de la fosforilación oxidativa es un paso de conservación de energía en el cual ésta es convertida a una forma que puede ser usada para la formación de ATP u otras funciones mitocondriales que demanden energía. La teoría quimioosmótica de Peter Mitchell es generalmente aceptada para explicar el mecanismo de acoplamiento de estos procesos. Esta teoría consiste en tres postulados:

a) la membrana interna es impermeable a protones y a hidroxilos,
b) la cadena respiratoria transloca protones hacia el medio extramitocondrial citosólico (dos protones por cada dos electrones) en un proceso vectorial acoplado al transporte de electrones a través de los sitios de conservación de energía, y
c) la ATPasa (ATPsintetasa) es una enzima que transporta vectorial y, reversiblemente, protones con una estequiometría característica: dos protones por Pi incorporado (o liberado) del ATP. La síntesis de ATP se relaciona con la entrada de protones a la matriz mitocondrial 17.


Los electrones son transportados a través de la cadena respiratoria y la energía liberada en la reacción redox es utilizada para excluir protones desde la membrana interna hacia el espacio intermembranas. Este proceso crea un potencial protomotriz a través de la membrana interna, con la subsiguiente reentrada de protones hacia el interior forzando a la enzima ATP sintetasa (unida a membrana), que cataliza la formación de ATP, a completar el proceso de fosforilación oxidativa.
Bibliografia


*S. Alvarez, Novoa Bermudez, María José y Boveris, Alberto. La mitocondria:
estructura, función y especies reactivas del óxigeno. Cátedra de Fisicoquímica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. 1994
* MW Gray, G Burger, BF Lang. Mitochondrial evolution. Science 1999

La cadena respiratoria: Los principales acarreadores redox que forman el sistema de transporte de electrones

Hay 2 tipos de cadenas de transporte electrónico:

- A favor de potencial de reducción con ΔG<0.>
- En contra de potencial de reducción, no espontáneo, ΔG>0. Aporte de energía.
La cadena pueden localizarse:
- Membrana interna de la mitocondria (eucariotas). En las bacterias que respiran en la membrana plasmática.
- En el cloroplasto en la membrana tilacoidal. Bacterias fotosintéticas en la membrana plasmática.

Cadena respiratoria.

La cadena respiratoria de la mitocondria es un conjunto de más de 20 transportadores de electrones distintos, asociados a un número indeterminado de péptidos estructurales.
La cadena respiratoria transfiere electrones desde el par NAD+/NADH hasta el par O2/2H20 lo que supone una diferencia de potencial redox.
Gran parte de la cadena respiratoria es reversible, y para catalizar tanto la reacción en una dirección como en la opuesta es necesario que los componentes redox funcionen en unas condiciones en las que tanto las formas oxidadas como las reducidas se encuentren en concentraciones apreciables.

Transportadores electrónicos

Los electrones proceden de la oxidación de nutrientes que, por la acción de deshidrogenasas, son transferidos a aceptores universales.

1. NAD y NADP: asociadas a deshidrogenasas, participan en la transferencia de 2 electrones.
2. Flavinas: implicadas en la transferencia de 1 o 2 electrones
3. Quinonas: implicadas en la transferencia de 1 o 2 electrones
4. Complejos hierro azufre, grupos hemo, iones cobre: implicados en transferencia de 1 solo electrón.

El potencial de reducción E° está relacionado con la energía libre de una reacción redox.
El flujo de electrones discurre desde moléculas con un E° mas negativo a otras de E° mas positivo.

Complejos de la cadena de transporte electrónico mitocondrial.

Los transportadores de electrones se asocian a proteínas formando 4 complejos multienzimáticos embebidos en la membrana interna mitocondrial.

• Complejo I: NADH-ubiquinona oxido-reductasa.

Transfiere los dos electrones del NADH a una flavina (FMN), que de uno en uno iran pasando por centros de Fe-S hasta reducir ubiquinona (Q): Proceso exergónico.
Por cada par de electrones transferido se bombean, desde la matriz hasta el espacio intermembrana, 4 protones: Proceso endergónico.



• Complejo II: succinato deshidrogenasa.


Toma electrones del succinato. Otros intermediarios metabólicos, el glicerol 3-fosfato y el acil-CoA, transfieren electrones a la ubiquinona sin pasar por el complejo II.
Los electrones pasarán a través de flavoproteínas (FAD) y varios centros de Fe-S hasta la ubiquinona.
En el complejo II no hay bombeo de protones.




• La Ubiquinona reducida (QH2)
Es un transportador de electrones móvil que se desplaza por la bicapa lipídica de la membrana interna mitocondrial.
Lleva dos electrones y dos protones, tomados del complejo I o del complejo II, hasta el complejo III.
• Complejo III: ubiquinona-citocromo C oxido-reductasa

Transfiere, de uno en uno, los dos electrones de la ubiquinona reducida el citocromo C. Para ello los electrones pasan por distintas subunidades que contienen grupos prostéticos hemo del tipo b y c y centros Fe-S, realizando el llamado ciclo Q.
El resultado neto de todo el proceso es el bombeo de 4 protones desde la matriz hasta el espacio intermembrana, por cada 2 electrones transferidos.
Se forman 2 citocromos reducidos por cada 2 elcetrones transferidos.

• Citocromo C: un intermediario móvil entre los complejos III y IV
A diferencia de la ubiquinona, transporta electrones de uno en uno y es hidrosoluble.

• Complejo IV: citocromo oxidasa
Lleva los electrones del citocromo C al oxígeno, reduciéndolo a H2O.
Contiene subunidades con grupos hemo tipo a y con centros binucleares que contienen iones Cu. Todos ellos implicados en la transferencia de electrones de uno en uno.
Por cada 4 electrones que pasan a través del complejo, se consumen 4 protones de la matriz para generar 2 H20 y otros 4 son bombeados al espacio intermembrana.
Las formas parcialmente reducidas del oxígeno son radicales libres muy tóxicos. Quedan retenidas en el complejo hasta que se forman 2 moléculas de H2O.

Balance total de la cadena respiratoria mitocondrial.

El flujo de electrones a través de los complejos I, III y IV implica el bombeo de unos 10 protones por cada 2 electrones.
Cuando la cadena se inicia en el complejo II, el bombeo neto será de 6 protones.
El gradiente de protones generado, permite la síntesis acoplada de ATP por la ATP sintasa (fosforilación oxidativa).

Transportadores necesarios para que funcione correctamente la fosforilación oxidativa.

El gradiente de protones favorece el funcionamiento de los 2 transportadores:

1. El translocador ADP-ATP
2. La translocasa de fosfato





Bibliografia:

*A. Barcelo, Hector. GUIAS DE ESTUDIO DE BIOLOGIA CELULAR. Facultad de medicina
*Ernster L, Lee C: Biological oxidoreductions. Annu Rev Biochem 1964
* Stoppani A, Boveris A: La mitocondria y la estructura de la cadena de transporte de electrones. En Bioquímica General (Torres H, Carminai H, Cardini C; Eds.) El Ateneo, Buenos Aires 1983

Experimentos con el oxímetro (Oxígrafo): mediciones de las razones P:O.

La presión parcial de oxígeno se expresa como la relación PO2. Con P nos referimos a la presión y la O representa la saturación de oxígeno. Si mencionamos SpO nos referimos a la saturación de oxígeno en la sangre arterial.

La oximetría es la medición del estado de oxigenación utilizando las propiedades diferenciales de absorción de la luz de la forma oxigenada y no oxigenada de la hemoglobina.

Los oxímetros de pulso evalúan la transmisión de la luz roja e infrarroja a través de un tejido translúcido con buen flujo sanguíneo (dedo o pabellón auricular) de manera no invasiva y estiman el porcentaje de oxihemoglobina y hemoglobina no oxigenada en el componente pulsátil de la señal (SpO2).

A partir del cociente de transmisión de luz roja/luz infrarroja se puede estimar la SpO2. Para un paciente respirando aire ambiente, en alturas no muy por encima del nivel del mar, se puede hacer una buena estimación de la pO2 arterial con un buen monitor.

Un oxímetro de pulso es un instrumento de medición particularmente conveniente y no invasivo. Normalmente, tiene un par de pequeños diodos emisores de luz (LED) de cara a un fotodiodo a través de una porción traslúcida del cuerpo del paciente, generalmente un dedo o el lóbulo de una oreja. Uno de los LED es de color rojo, con longitud de onda de 660 nm, y el otro está en el infrarrojo, 905, 910, o 940 nm. La absorción de estas longitudes de onda es muy diferente entre la oxihemoglobina y su forma desoxigenada, por lo tanto, de la relación entre la absorción de la luz roja e infrarroja se puede calcular la diferencia entre la oxi y desoxihemoglobina.

La absorbancia de la oxihemoglobina y desoxihemoglobina es la misma (punto isosbéstico) para las longitudes de onda de 590 y 805 nm; los primeros oxímetros usaban estas longitudes de onda para la corrección de la concentración de hemoglobina.

La relación P/O es el número de moles de ADP fosforilados por cada par de electrones que fluye hacia el oxígeno.
Bibliografia
* B. Jackson, Meyer. Molecular and Celular Biophysics. Cambrige. University of Winsconsin 2006.
**Juli G, Peretó. Fundamentos de bioquímica. Volumen 96 de Educación Universidad de Valencia Ed. Universitat de València, 2007

El electrodo de oxígeno: Diseño, teoría y operación práctica del electrodo de oxígeno

Una de las metodologías posibles para determinar la respiración celular o mitocondrial es cuantificar el consumo de oxígeno en preparados de células o mitocondrias. Esta cuantificación se puede realizar mediante diferentes técnicas; una de las más sencillas es el electrodo un oxígeno.

Electrodo de oxígeno

El electrodo de oxígeno comprende un cátodo de platino central (B) unido a una resina y un ánodo de plata (C) concéntrico unido por un puente electrolítico y conectados al módulo control.
La cámara del electrodo es preparada por aplicación de un espaciador de papel muy fino y una fina membrana de poli-tetra-fluor-etileno (P.T.F.E.) que es cuidadosamente fijada a la placa base donde se encuentran los electrodos por un anillo-O. En la presencia de oxígeno una pequeña corriente fluye a través de los electrodos que es proporcional a la concentración de oxígeno en la muestra. Esta señal es digitalizada por la unidad de control y presentada directamente en el PC.
Estos electrodos pueden ser acondicionados para medidas en fase líquida o en fase gaseosa.

Todas las unidades del electrodo deben mantenerse a temperatura constante durante las determinaciones. Este efecto se consigue por circulación de agua a la temperatura deseada alrededor de la cámara y controlando la temperatura de los componentes de la muestra. Este control es importante por dos razones:

1º.- El electrodo es sensible a la temperatura
2º.- El contenido en oxígeno de las muestras acuosas saturadas de aire cambia con la temperatura.

Durante la medida, el electrodo consume una pequeña proporción del oxígeno disponible. Para evitar registrar un declive en la señal debido a este artefacto, las muestras deben estar continuamente en agitación de forma que la capa de líquido, situada encima del disco del electrodo, sea constantemente repuesta en oxígeno.



Bibliografia

* J. F. Tresguerres, Jesaus A. Fernaandez-Tresguerres Hernandez. Biotecnología aplicada a la medicina. Editor Ediciones Díaz de Santos, 2003. 328 pp
* http://www2.uah.es/tejedor_bio/bioquimica_ambiental/guion-res-mitocondrial.pdf

Enfermedades mitocondriales: errores innatos del metabolismo que involucren a la mitocondria. Reacciones autoinmunes.

Las enfermedades mitocondriales son resultado de la falla de las mitocondrias, los compartimentos especializados presentes en cada célula del cuerpo, con excepción de los glóbulos rojos de la sangre. Las mitocondrias son las responsables de la creación de más del 90% de la energía que el cuerpo necesita para mantener la vida y apoyar el crecimiento. Cuando fallan, se genera cada vez menos energía al interior de la célula. Puede entonces presentarse lesión celular o incluso la muerte de la célula. Si este proceso se repite en todo el cuerpo, los sistemas completos comienzan a fallar

Apoptosis.

La mitocondria es un orgánulo que juega un papel muy importante en la apoptosis celular. Se trata de un colapso de la célula que comienza con la formación de de burbujas en la membrana plasmática y conlleva la fragmentación de proteínas, condensación de la cromatina, disminución del volumen celular y la degradación del ADN. El proceso termina con la formación de cuerpos apoptóticos que evitan la salida de todos estos compuestos al exterior y posible daño a células colindantes.

Existen dos vías de activación de la apoptosis:

• Vía extrínseca, intervienen receptores de muerte como FAS y FADD que se encuentran situados en la membrana citoplasmática y al unirse con sus ligandos específicos llevan a la activación de las caspasas.
• Vía intrínseca, esta es la mas importante en relación con la mitocondria. El citocromo C oxidado y otras proteínas se liberan de la mitocondria al citosol, señalización dada por por la proteína p53. Fuera de la mitocondria, el cit C se une a Apaf1, y a ellas se una la caspasa 9. Así se forma el apostosoma, que corta la procaspasa 3 e inicia la apoptosis. Esta vía puede ser activada por estrés oxidativo o por daño en el DNA.



Uno de los aspectos importantes en la patogénesis de las enfermedades vinculadas con la fosforilación oxidativa es una excesiva producción de especies reactivas del oxígeno, cuyos mecanismos ya han sido descriptos previamente. El otro aspecto es la capacidad de la mitocondria para virar hacia el estado de apoptosis. Este viraje aparentemente involucra la apertura de un canal inespecífico interno llamado poro de permeabilidad mitocondrial de transición (mtPTP). El espacio de la membrana interna mitocondrial contiene un número de factores proapoptóticos incluyendo el cyt c, el factor inductor de apoptosis y las caspasas.

La apertura del mtPTP produce colapso del gradiente electroquímico, que conduce al edema de la membrana interna mitocondrial con liberación de los factores apoptóticos. El cyt C activa la vía de la degradación proteica de las caspasas lo que produce destrucción del citoplasma.



Las enfermedades mitocondriales poseen una amplia variedad de elementos heredados y los fenotipos pueden ser diversos y superpuestos. Es decir que una misma mutación del mtDNA puede producir diversos fenotipos, y diferentes mutaciones pueden producir fenotipos similares. Por lo tanto en las patologías que tienen su origen en la mitocondria se ha considerado más adecuado clasificar a los pacientes por su defecto genético más que por sus manifestaciones clínicas.



Estas enfermedades por lo general tienen un inicio tardío y son de curso progresivo. Esto significa que la expresión fenotípica de estas enfermedades comprende dos factores: una predisposición a la mutación y un factor relacionado con la edad que produce una declinación de la función mitocondrial que a su vez exacerba el efecto heredado. La tabla nos muestra los síndromes clínicos más conocidos secundarios a defectos de mtDNA.

Bibliografia

*Boveris. Alberto. La mitocondria: estructura, función y especies reactivas del óxigeno. Antioxidantes y Calidad de Vida. Cátedra de Fisicoquímica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. 1994
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*Lestienne P: Mitochondrial DNA mutations in human disease: A review. Biochimie 1992

Descubrimiento, aislamiento y propiedades de la mitocondria y sus componentes principales.






Es el sitio donde se lleva a cabo la respiración celular, el metabolismo aerobio, en la mayoría de los organismos eucariontes. Lo anterior fue demostrado por A. Lenhinger y E. Kennedy en 1948. Este organelo fue descubierto en el siglo XIX.

1880-1888- Probablemente las primeras observaciones se deben al botánico suizo Kolliker, quien notó la presencia unos gránulos en células musculares de insectos a los que denominó sarcosomas. Llegó a la conclusión de que presentaban membrana.

1882- El alemán Walther Flemming descubrió una serie de inclusiones a las que denomina fila.

1884- Observaciones por Richard Altmann, quien más tarde en su obra publicada en Leipzig Die Elementarorganismen describe una serie de corpúsculos que observa mediante una tinción especial que incluye fucsina. Especula que se trata parásitos independientes, con su propio metabolismo y los denomina bioblastos.

1916- El anterior hallazgo fue rechazado como un artefacto de la preparación, y sólo más tarde fue reconocido como mitocondrias por N.H. Cowdry. También los "plastídulos" del protozoólogo italiano Leopoldo Maggi podrían tratarse de observaciones tempranas de mitocondrias.

1889- Carl Benda, denominó "mitocondria" a unos gránulos que aparecían con gran brillo en tinciones de violeta cristal y alizarina, y que anteriormente habían sido denominados "citomicrosomas" por Velette St. George.

1904- F. Meves confirma su presencia en una planta, concretamente en células del tapete de la antera de Nymphaea

1913- Otto Heinrich Warburg descubre la asociación con enzimas de la cadena respiratoria, aunque ya Kingsbury, en 1912 había relacionado estos orgánulos con la respiración celular.

1934- Fueron aisladas por primera vez a partir de homogeneizados de hígado

1948- Hogeboon, Schneider y Palade establecen definitivamente la mitocondria como el lugar donde se produce la respiración celular.

1963- La presencia del ADN mitocondrial fue descubierta por Margit M. K. Nass y Sylvan Nass.

Propiedades

La mitocondria consta de 2 membranas paralelas separadas por un espacio estrecho (membrana externa e interna en razón a su ubicación) o interestructural.
La membrana mitocondrial externa es lisa y contiene porinas, lo que permite el libre paso de moléculas mayores de 10 kD entre la mitocondria y el citosol.

El espacio entre ellas esta ocupado por una sustancia homogénea denominada matriz mitocondrial que es de menor opacidad a los rayos electrónicos, contienen enzimas del ciclo del acido citrico . La membrana interna emite hacia el interior de la mitocondria evaginaciones laminares a manera de tabiques incompletos que no llegan a segmentar el espacio interestructural. Estas prolongaciones se denominan crestas mitocondriales.

Particulas elementales

Dentro de la membrana interna encontramos estructuras que miden entre 80 a 100 A y estan distribuidas en la superficie de la membrana interna. Su número varía entre 10000 a 100000 por mitocondria. Cada particula consta de cabeza, tallo y pieza basal. La cabeza mide 100 amstrongs de diametro y el pediculo mide 40 a 50 amnstrongs aprox.
Se sostiene que las particulas elementales contienen enzimas que participan en el transporte de electrones y fosforilacion oxidativa.

Matriz mitocondrial

En el espacio intraestructural se encuentra la matriz que contiene algunos granulos esfericos escasos de aprox 50 amnstrongs; tambien algunos filamentos. Se les vincula probablemente con ADN, tambien se demostro la existencia de metales bivalentes, calcio, magnesio y estroncio ademas de vitaminas.
La matriz está formada casi por un 50% de de agua, contiene alta concentración de enzimas solubles para el metabolismo oxidativo, asi como substratos, cofactores e iones inorgánicos. Contiene la maquinaria genética propia del organelo, ADN, ARN y ribosomas que participan en la síntesis de algunos componentes protéicos mitocondriales, el resto de las proteínas son importadas del citoplasma después de su expresión desde el núcleo.

Las membranas mitocondriales estan costituidas por fosfolipidos y proteinas en una proporcion de 1/5 a favor de las proteinas .ambos materiales se unen formando un reticulo lipido proteico.

Todas las funciones dependen del aporte continuo de energía obtenido al degradar moléculas orgánicas durante la respiración celular.

En la mitocondria tienen lugar las siguientes funciones:

 Oxidación del piruvato o ácidos grasos a co2, acoplada a la reducción de los portadores electrónicos nad+ y fad (a nadh y fadh2). Estos ceden sus electrones a la cadena de transporte electrónico.
 Transferencia de electrones desde el nadh y fadh2 al o2, acoplada a la generación de fuerza protón-motriz.
 Utilización de la energía almacenada en el gradiente electroquímico de protones para la síntesis de ATP por el complejo ATPasa.


Bibliografia

*Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson D. Molecular biology of the cell. Nueva York. Garland Publishing Inc, 2000.

*Stoppani A, Boveris A: La mitocondria y la estructura de la cadena de transporte de electrones. En Bioquímica General (Torres H, Carminai H, Cardini C; Eds.) El Ateneo, Buenos Aires 1983; 453-473.

Biogénesis de la mitocondria: DNA mitocondrial.



Las mitocondrias son orgánulos subcelulares cuya misión principal es la producción de energía en forma de ATP. Estos orgánulos contienen su propio sistema genético que codifica un número pequeño de proteínas que forman parte del sistema de fosforilación oxidativa. El resto de las proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo.

La biogénesis de la mitocondria requiere la expresión coordinada de los dos sistemas genéticos celulares, el nuclear y el mitocondrial. Los genes están dispuestos en el DNA mitocondrial humano de una forma compacta y no contienen intrones.
Se conocen bastante bien los mecanismos básicos de replicación y transcripción del DNA mitocondrial, así como los elementos y proteínas implicadas. La mitocondria posee, asimismo, su propia maquinaria para la síntesis de las proteínas codificadas en su genoma.
La genética del DNA mitocondrial difiere de la del DNA nuclear en una serie de propiedades. En particular, el genoma mitocondrial se hereda exclusivamente de la madre que lo transmite a todos sus hijos.


Importación de proteínas codificadas en el núcleo hacia la mitocondria.

Los mecanismos de exportación de proteínas, desde el núcleo, fueron descritos en 1958 por Goldstein en experimentos de transplante de núcleos de Amaeba.
Se han identificado una serie de secuencias NES (Nuclear Export Sequence). Este transporte es saturable, indicando la existencia de un receptor.
El transporte entre el citoplasma y el núcleo tiene lugar a través de los poros nucleares que actúan de forma selectiva permitiendo la difusión de moléculas de pequeño tamaño y siendo necesario un mecanismo de transporte activo para moléculas de mayor tamaño denominado transporte regulado.

Aunque la contribución del ADNmt es esencial, la mayor parte de la información para la función y biogénesis mitocondrial se encuentra en el genoma nuclear. Estos genes, son transcritos y eventualmente traducidos en el citosol.

Las proteínas resultantes son posteriormente transportadas al compartimento mitocondrial. Uno de los requerimientos para la importación exitosa de la mayoría de proteínas, es la presencia de un péptido señal o presecuencia mitocondrial, es decir, una extensión polipeptídica en el extremo amino terminal de la proteína que dirige a la proteína recién sintetizada hacia la mitocondria.

Esta presecuencia es generalmente pequeña (de 20 a 60 residuos de aminoácidos), capaz de formar una alfa-hélice anfifílica, que puede ser reconocida por la maquinaria de importación mitocondrial.
El tránsito de las proteínas desde el citoplasma hasta su destino final en alguno de los compartimentos mitocondriales requiere, además de las presecuencias mitocondriales, a chaperonas citosólicas y de la matriz mitocondrial, receptores localizados en la superficie
mitocondrial, proteínas que rodean los canLista numeradaales de paso y proteínas de maduración.

La inserción de las presecuencias en la membrana interna requiere además, en la mayoría de los casos, que en la mitocondria exista un potencial electroquímico (ΔΨ), para promover el movimiento electroforético de cargas positivas a través del aparato importador.
Finalmente, una proteasa de la matriz mitocondrial cataliza (MPP) la remoción proteolítica de la presecuencia mitocondrial, obteniéndose así, una proteína madura.
Las proteínas cuya localización funcional se restringe a la membrana externa mitocondrial, suelen no presentar presecuencia. Al ser reconocidas por los receptores mitocondriales de la membrana externa, son transportadas a su destino final en la membrana externa o en el espacio
intermembranal.

Una vez en la matriz mitocondrial la secuencia señal se elimina y tiene lugar el plegamiento de la proteína.


En el esquema se muestran los diferentes compartimentos mitocondriales: ME, membrana externa (arriba); MI, membrana interna (abajo); C, citosol; EI, espacio intermembranal; M, matriz mitocondrial. Las proteínas que poseen presecuencia o señales, interaccionan con la superficie externa mitocondrial a través de receptores (R). Aquellas proteínas que se localizan en la matriz o membrana interna se translocan a través de complejos en la membrana interna. En la matriz mitocondrial, estas porteínas interaccionan con la chaperona mitocondrial (heat shock protein mHSP70) y la proteasa (MPP). Esta última corta específicamente a las presecuencias o péptido señal, para generar a las proteínas maduras; que posteriormente entran en contacto con las proteínas involucradas en la inserción de proteínas para su correcta localización en la membrana interna. Aquellas proteínas que carecen de presecuencia, pero que putativamente contienen una secuencia señal interna (una secuencia de la propia proteína madura), ingresan a través de un camino distinto sin llegar a la matriz mitocondrial. La importación de proteínas requiere la presencia de un gradiente electroquímico (ΔΨ) en la membrana interna mitocondrial.

Bibliografia



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*Laskowski, Wolfgang; Pholit, Wolfgang. Biofisica. Ediciones Omega S.A. Casanova, 220. Barcelona. 1976

Origen y evolución de la mitocondria





Las mitocondrias tienen similitudes con las bacterias como tamaño y forma pero existen muchas más. La matriz mitocondrial, contiene DNA, RNA y ribosomas que participan en la síntesis de algunos componentes mitocondriales, el resto de los componentes es importado del citoplasma después de su expresión desde el núcleo.

Se sabe que, a pesar de esto, las mitocondrias se reproducen por fisión binaria y además su proceso respiratorio es similar al observado en bacterias aerobias actuales. A partir de estas observaciones, Lynn Margulis propuso que el origen de las mitocondrias modernas es a partir de la endosimbiosis de bacterias aerobias con eucariontes anaerobios antiguos. El origen de diversos organelos también se puede explicar a partir de la teoría endosimbiótica.

Hipótesis endosimbiótica.

Como lo mencione anteriormente, esta hipótesis fue desarrollada por la bióloga Lynn Margulis.
Esta es una hipótesis plausible del origen de los eucariotas que dice que un procariota primitivo con metabolismo anaeróbico, heterótrofo endocitó procariotas aeróbicos. Sin embargo, los aeróbicos capturados pudieron resistir a la estructura intracelular y siguieron viviendo en el citoplasma de la célula huésped de modo simbiótico, desarrollándose como mitocondrias y ocupándose de volver el metabolismo aeróbico y energéticamente eficiente.
Se habría producido una endosimbiosis en serie y algunos autores hablan de la célula eucariota vegetal como una comunidad microbiana bien organizada.

La endosimbiosis primaria resulta de asociaciones ancestrales y que suponen una gran alteración del ADN de la bacteria y del hospedador, que se ha adaptado para mantenerlas. Posteriormente se han producido otras endosimbiosis de cianobacterias en células eucariotas con mitocondrias denominadas endosimbiosis secundarias y terciarias.


Una endosimbiosis secundaria ocurrió cuando una célula eucariota con mitocondrias endocito a otra eucariota que ya contenía cloroplastos y mitocondrias. Con el tiempo la célula incorporada pasó a ser endosimbionte. La célula endocitada perdió el núcleo, o se atrofió, y su cloroplasto pasó a trabajar y a depender de la célula eucariota donde se incorporó. La endosimbiosis terciaria resulta cuando una célula eucariota que había sufrido una endosimbiosis secundaria incorpora a otra eucariota que también era resultado de una endosimbiosis secundaria.

También se supone que la célula huésped generó otros orgánulos celulares mediante plegamientos de su membrana plasmática lo que, finalmente, transformó al procariota aeróbico heterótrofo en eucariota unicelular.


La Eva mitocondrial.

Esta hipótesis se sustenta en estudios realizados con el ADN contenido en las mitocondrias que se encuentran en todas las células. Las mitocondrias contienen sistemas enzimáticos altamente integrados que aportan energía para el metabolismo celular, es decir, para la vida misma de las células. Cuando en la fecundación se fusionan el óvulo y el espermatozoide, las únicas mitocondrias que van a formar parte de las células del embrión que se forma proceden del óvulo, de manera que el ADN mitocondrial se hereda solo por línea materna.

El ADN nos permite seguir el rastro de sus estructuras hacia atrás. Esto puede hacerse por miles de generaciones hasta llegar a la “abuela” ancestral de la especie humana.

Esta Eva vivió en África hace 150 mil años y pertenecía a una tribu de la cual todos los seres humanos descendemos. Como los seres humanos solo heredámos ADN mitocondrial materno, podemos decir que somos parientes y este ADN nos unifica.

Bibliografía.


*Alvarez, Silvia; Novoa Bermudez, Ma. José; Boveris, Alberto "La mitocondria:
estructura, función y especies reactivas del óxigeno" Antioxidantes y Calidad de Vida. Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, 1994
*Alberts, B., Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson D. "Molecular biology of the cell" 3a. Ed. Nueva York. Garland Publishing Inc, 2000
*Álvarez Iglesias, Vanesa "Estudio multidisciplinar de la variabilidad del ADN mitocondrial en poblaciones humanas" Editor Univ Santiago de Compostela